Plantas Curativas


Actividad antiinflamatoria y perfil fitoquímico de Galinsoga Parviflora Cav.

1. Introducción

La inflamación es una respuesta protectora clave a la lesión tisular. Sin embargo, si no se controla, puede producir algún daño colateral y contribuir a una mayor destrucción de los tejidos. La reacción inflamatoria está regulada en muchos niveles por citocinas, eicosanoides, moléculas de adhesión, oxígeno reactivo y especies de nitrógeno. Los intentos farmacológicos para reducir la inflamación incluyen inhibidores de citocinas, antagonistas o receptores solubles, antioxidantes y mediadores pro-resolutivos.

Muchas plantas medicinales utilizadas con éxito en la medicina popular muestran propiedades antiinflamatorias, aunque los mecanismos moleculares exactos por los que producen estos efectos beneficiosos a menudo están mal definidos. Se ha demostrado que provocan control transcripcional o postranscripcional de la expresión génica, inhibición de citocinas proinflamatorias y eicosanoides y / o actividad antioxidante [ 1 ].

El valiente soldado ( Galinsoga parviflora Cav.) (GP) es una hierba anual cosmopolita de la familia Asteraceae . Las hojas frescas y el jugo de GP se han utilizado en la medicina popular en todo el mundo para tratar trastornos dermatológicos como eccema, liquen y heridas sangrantes o que no cicatrizan [ 2 ]. Con menos frecuencia, el médico de cabecera se administra por vía oral para curar el resfriado común, la gripe y el herpes labial. La GP también se ha utilizado como agente antiescorbuto debido al alto nivel de vitamina C. Además, la GP puede reducir la activación de una respuesta inflamatoria y posee propiedades analgésicas. Los extractos acuosos de partes aéreas de GP tienen efectos protectores contra los daños por irradiación UV [ 2 , 3 , 4 , 5]. Se ha encontrado que los extractos de la parte aérea de GP ejercen importantes actividades antibacterianas, antifúngicas [ 6 ] y antivirales [ 7 ]. A su vez, el aceite esencial de GP puede inhibir el crecimiento de S. aureus y B. cereus [ 8 ]. Varios compuestos químicos y extractos de gallant soldier han mostrado actividades α-glucosidasa, hepatoprotectora, nematicida e hipoglucemiante. El uso de GP como alimento por parte de los humanos para hacer ensaladas y sopas en América Latina y América del Norte demuestra que la planta no es tóxica [ 2 , 3 , 4 , 5 ].

El objetivo del presente estudio fue examinar la actividad antiinflamatoria, antihialuronidasa y anti-antioxidante del extracto hidroalcohólico de GP y evaluar el proceso de curación (in vitro) en lo que respecta al perfil fitoquímico de GP.Ir:

2. Resultados

2.1. Análisis fitoquímico y cuantificación de los principales compuestos

2.1.1. Aislamiento de flavonoides

En el estudio actual, se aislaron siete flavonoides conocidos a partir de extractos de acetato de etilo y agua de la hierba GP mediante cromatografía en columna de celulosa. Sus estructuras se identificaron en base a análisis espectroscópicos ( 1 H-NMR, 13 C-NMR y / o ESI-MS) en comparación con la literatura [ 9 , 10 ] (ver Materiales complementarios ).

2.1.3. Contenido total de fenólicos y flavonoides

El contenido fenólico total (TPC) y el contenido total de flavonoides (TFC) del extracto de GP fueron 98,30 ± 0,14 mg equivalente de ácido clorogénico / g de hierba seca y 6,15 ± 0,41 mg / equivalente de quercetina / g de hierba seca, respectivamente.

2.2. Ensayo de bioactividad

2.2.1. Ensayo LAL

Se consideró aceptable una concentración de endotoxinas de <0,01 ng / ml en el extracto de GP y este extracto se utilizó para estudios in vitro adicionales. La concentración de GP fue <1,0 mg / ml.

2.2.2. Ensayo de viabilidad y proliferación

La exposición de células endoteliales al extracto de GP en concentraciones de hasta 1 mg / ml no afectó la viabilidad celular, que se mide mediante la prueba de exclusión con azul tripán (Figura 2UN). El extracto de GP a una dosis de 0,5 mg / ml también estimuló ligeramente la proliferación de células endoteliales. Sin embargo, el crecimiento de las células tratadas con la concentración de GP al doble de una cantidad no tuvo ningún efecto significativo (Figura 2SEGUNDO).

Efecto del extracto de G. parviflora (GP) sobre la viabilidad ( A ) y la proliferación ( B ) de las células endoteliales . Las células se trataron con el extracto de GP o el control del vehículo durante 24 horas y luego se evaluó la viabilidad (prueba de exclusión con azul tripán) y la proliferación (prueba MTT). Los datos se derivaron de tres experimentos independientes. Los datos expresados ​​como media ± DE. Los asteriscos representan una diferencia significativa en comparación con las células de control (* p <0,05).

2.2.3. Mediciones de citocinas

Ninguna de las concentraciones probadas del extracto de GP cambió la liberación constitutiva de IL-6 por las células endoteliales (figura 3UN). En contraste, la exposición al GP resultó en una disminución dependiente de la dosis en la secreción de IL-6 estimulada por IL-1β (figura 3SEGUNDO). La concentración más alta de GP provocó la liberación de IL-6 estimulada por Il-1β, que se redujo al 33% ± 9%.

figura 3

Efecto del extracto de G. parviflora (GP) sobre la liberación de IL-6 por las células endoteliales. Las células se trataron con un extracto de GP en ausencia ( A ) o presencia ( B ) de Il-1β (1 ng / mL) durante 24 h. Los datos se obtuvieron de cuatro experimentos independientes y se expresan como parentesco de control (media ± DE). La liberación de IL-6 se detectó como pg / µg de proteína celular. Los asteriscos representan una diferencia significativa en comparación con las células de control (* p <0,5).

2.2.4. Actividad antihialuronidasa

Los resultados de un ensayo de actividad anti-hialuronidasa se muestran en Figura 4. El estudio mostró que el extracto de GP (IC 50 = 0,47 mg / ml) exhibió una actividad más fuerte que el control positivo kaempferol (IC 50 = 0,78 mg / ml).

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Figura 4

Actividad antihialuronidasa del extracto de G. parviflora (GP) y la sustancia de referencia. Los resultados se presentan como valores medios ± SD ( n = 3 × 2) representado por las barras de error, IC 50 , 50% de inhibición de la actividad enzimática.

2.2.5. Actividad antioxidante

El ensayo FRAP reveló una potente propiedad antioxidante del extracto de GP con una IC estimada de 0,5 = 498,2 µg / ml de la hierba seca en comparación con una IC 0,5 = 44,40 µg / ml del ácido l -ascórbico.

2.2.6. Medición de especies reactivas de oxígeno (ROS)

El extracto de GP redujo la generación de ROS en función de la dosis por las células endoteliales. En las células tratadas con el extracto de GP a 1,0 mg / ml, el nivel de ROS intracelular se redujo en aproximadamente un 30%. El efecto del extracto de GP se vio claramente en células marcadas independientemente con dos tintes diferentes H 2 DCFDA y DHR usando un cultivo in vitro (Figura 5A, B). Haciendo experimentos con marcaje DCFDA in vitro, usamos como control positivo H 2 O 2 . La producción de ROS en respuesta al peróxido de hidrógeno fue del 196% ± 7% en comparación con las células de control. La reacción al H 2 O 2 suele ser entre un 80% y un 150% más alta que la observada en la línea EA.hy926 de la célula de control HUVEC (observación personal).

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Figura 5

Efecto del extracto de G. parviflora (GP) sobre la producción de ROS endoteliales. La línea EA.hy926 de HUVEC se trató con extracto de GP o control de vehículo durante 24 h. ( A ) La generación de ROS se midió después del marcado con H2DCFDA. Los datos se derivaron de tres experimentos independientes y se expresan como porcentaje del control. El control positivo es peróxido de hidrógeno (100 µM). Los asteriscos representan una diferencia significativa en comparación con las celdas de control. ( B ) La generación de ROS se midió mediante citometría de flujo después del etiquetado con DHR. Los datos se obtuvieron de cinco experimentos independientes y se expresan como media ± DE. Los asteriscos representan una diferencia significativa en comparación con las células de control (* p <0,5, **** p <0,0001).

2.2.7. Cicatrización de la herida

Exposición de las células endoteliales al extracto de GP en concentración 0.5 mg / mL y 1 mg / mL, que provocó la curación completa del daño después de 12 h del estudio (Figura 6). La cinética de regeneración no difirió significativamente entre los grupos evaluados.

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Figura 6

Efecto del extracto de G. parviflora (GP) sobre la regeneración de la cicatrización de heridas. Las células se trataron con el extracto de GP o el vehículo de control durante 12 horas y luego se evaluó la regeneración (microscopía de lapso de tiempo). Los datos se derivaron de ocho experimentos independientes que prueban la regeneración celular. Los datos expresados ​​como media ± DE.Ir:

3. Discusión

Las sustancias naturales se utilizan a menudo para el tratamiento de la inflamación de la piel y la cicatrización de heridas. Una de las plantas utilizadas para este fin en la medicina popular es G. parviflora. En nuestro estudio comprobamos si el uso de extracto hidroalcohólico de esta especie vegetal tiene una justificación científica.

La definición de los perfiles químicos de los extractos de plantas puede justificar su actividad biológica. Los estudios fitoquímicos de G. parviflora confirmaron la presencia de varios compuestos fenólicos con potencial actividad biológica.

A partir de partes aéreas de G. parviflora utilizadas para preparar el extracto hidroalcohólico para el ensayo de bioactividad, aislamos siete flavonoides y los identificamos por ESI-MS, 1 H y 13 C-NMR como miquelianina, isoquercitrina, rutina, astragalina, quercimeritrina, quercetagetrina. y patulitrina. Como resultado del análisis LC-MS anterior del extracto de GP, también se detectaron las diferentes flavonas, flavonoles y flavanonas [ 2 , 11 , 12 , 13 , 14 ].

Nuestro estudio UPLC del extracto hidroalcohólico GP reveló la presencia de cinco ácidos fenólicos. Aparte de los protocatechicos, clorogénicos, 4-hidroxibenzoicos y cafeicos, que se encontraron en los estudios anteriores [ 15 , 16 , 17 ]. Además, detectamos la presencia de ácidos isovanílico pero no cafeoilglucárico [ 17]. Nuestros resultados mostraron que el ácido clorogénico es el componente principal del grupo de ácidos fenólicos en el extracto de GP y su concentración total fue de 2,00 ± 0,01 mg / g de la hierba seca. El contenido de ácidos protocatechico, 4-hidroxibenzoico, cafeico e isovanílico asciende a (µg / g de la hierba seca) 200,32 ± 4,3, 100,43 ± 0,2, 120,54 ± 2,8 y 60,38 ± 1,6, respectivamente. El contenido de ácido clorogénico detectado en nuestro extracto de GP fue comparable con el previamente determinado por Ranilla et al. [ 16 ].

El análisis del contenido de polifenoles totales mostró su alta cantidad en nuestro extracto hidroalcohólico. El análisis similar de extractos metanólicos y acuosos de G. parviflora , que contenían 15,3 y 24,1 mg de ácido gálico / g de hierba seca, respectivamente, fue realizado por Akula et al. [ 18 ]. A pesar de los estudios de Akula, el contenido se expresó como equivalente de ácido gálico. Podemos afirmar que el extracto hidroalcohólico es un preparado rico en compuestos polifenólicos. Los resultados obtenidos de flavonoides totales indican su contenido moderado en el extracto de GP examinado. Nuestros resultados del análisis fitoquímico del extracto GP proporcionan información más detallada sobre los perfiles de flavonoides y ácidos fenólicos de esta especie vegetal.

El siguiente paso de nuestro estudio fue la evaluación de las propiedades biológicas del extracto de GP, que son importantes para apoyar el tratamiento de la inflamación. La inflamación es un proceso multifactorial y de varias etapas que se acompaña de varios factores, como el alto nivel de producción de interleucina y el aumento de la actividad hialuronidasa [ 19 ]. Es obvio que la actividad excesiva de la hialuronidasa provoca vasodilatación, aumenta la permeabilidad y, como consecuencia, enrojecimiento y edema locales.

En el presente estudio, mostramos por primera vez que el extracto de GP causó una reducción dependiente de la dosis de la secreción de IL-6 en las células endoteliales estimuladas por IL-1β y la liberación disminuyó significativamente en ambas concentraciones estudiadas (figura 3). El estudio anterior mostró que los extractos etanólicos de GP inhiben la vía inflamatoria del ácido araquidónico al bloquear la actividad de la ciclooxigenasa (COX-1) [ 20 ] y la lipoxigenasa (5-LOX) [ 18 ]. Además, la GP puede reducir la activación de la respuesta inflamatoria [ 21 ]. Varios modelos in vitro e in vivo han demostrado claramente la actividad antiinflamatoria de varios fenólicos como el ácido clorogénico, la rutina y la quercetina 3- O -β-glucurónido, que también están presentes en el extracto de GP examinado en nuestro estudio [ 22 , 23 , 24]. La actividad de estos compuestos resultó en la disminución de la secreción de citocinas proinflamatorias IL-6 en células estimuladas con TNF-α, LPS e IL-1β. Por lo tanto, se puede suponer que estos ingredientes GP son responsables del efecto antiinflamatorio [ 25 , 26 ].

Nuestro estudio reveló que el extracto de GP inhibió completamente la actividad hialuronidasa a la concentración de 2,50 mg / ml (Figura 4). Se ha demostrado que la actividad inhibidora de la hialuronidasa es característica de los derivados de la quercetina (rutina y quercetina 3- O -β-glucurónido) y es superior a la de los ácidos fenólicos (clorogénico y protocatecuico) [ 27 , 28 , 29 ]. La presencia de rutina y el alto contenido de compuestos fenólicos, especialmente ácido clorogénico en el extracto de GP hidroalcohólico, pueden justificar la actividad antihialuronidasa.

La inflamación también está asociada con la generación de grandes cantidades de radicales libres. El estrés oxidativo es capaz de activar factores de transcripción (p. Ej., NF-κB) que promueven la síntesis de citocinas proinflamatorias (p. Ej., IL-6). A este respecto, se ha demostrado que los antioxidantes pueden reducir la IL-6 y el TNF-α por los macrófagos [ 30 ] e inhibir la expresión de ciclooxigenasa-2 y óxido nítrico sintasa inducible [ 31 ], así como mejorar la secreción antiinflamatoria de IL-10 [ 30]. Para evaluar la actividad antioxidante del extracto de GP rico en polifenoles, se aplicaron dos utilizados en modelos in vitro. En nuestro estudio, el extracto de GP exhibió una actividad antioxidante moderada dependiente de la concentración. La actividad analizada utilizando un ensayo FRAP fue 11 veces menor en comparación con la vitamina C. Las propiedades antioxidantes del extracto GP también se confirmaron midiendo la producción de ROS por células endoteliales utilizando DHR y DCFDA. Los datos demostraron un amplio espectro de actividad del extracto examinado sobre la concentración de ROS en las células.

En la investigación de otros autores también se documentó una actividad antioxidante interesante de diferentes extractos de GP. El estudio de Bazylko et al. [ 17 ] implicó la captación de dos radicales (O • – y H 2 O 2 ) generados por fibroblastos en sistemas libres de células y en la piel humana después de la irradiación UV con extractos de GP metanólicos y acuosos. Estudios anteriores también han indicado que GP inhibe la oxidación del ácido linoleico y es capaz de eliminar ROS [ 11 , 16 , 18 ]. Chanaj-Kaczmarek y colaboradores detectaron una potente actividad antioxidante con valor IC 50 = 47,21 µg / mL e IC 50= 66,38 µg / mL para decocción y extracto metanólico al 70%, respectivamente, utilizando el ensayo ABTS. Además, la actividad antioxidante se probó utilizando un método de la cepa de levadura Saccharomyces cerevisiae sin el gen sod1. La decocción y el extracto al 70% mejoraron la viabilidad de S. cerevisiae debido a la actividad antioxidante de los compuestos fenólicos, especialmente los ácidos fenólicos [ 32 ]. Las propiedades antioxidantes de GP probadas en nuestro análisis, así como en los otros estudios de investigación, sugieren que esta especie de planta puede ejercer un efecto beneficioso en los síntomas asociados con la inflamación.

Muchos informes han demostrado que los flavonoides (p. Ej., Kaempferol, quercetina) favorecen la aceleración del cierre de heridas a través de un mecanismo complejo que implica la inducción de vías intercelulares dependientes del calcio, la estimulación de la deposición de colágeno y la supresión de la expresión de ciclooxigenasa-2 (COX-2) [ 33 , 34 ]. En el caso del ácido clorogénico, se ha demostrado una aceleración significativa del cierre de la herida de los queratinocitos medido por un ensayo de raspado [ 35 ]. Además, un estudio realizado por Schmidt mostró que los extractos de GP con hexano y etanol promueven la migración y proliferación de fibroblastos y, por lo tanto, facilitan la cicatrización de heridas [ 21 ]. Los resultados de estos estudios no se han confirmado en nuestra investigación.

Nuestro estudio, que se llevó a cabo en células endoteliales, mostró que el extracto de GP hidroalcohólico mejoró ligeramente el proceso de proliferación. A pesar del alto contenido de ácido clorogénico y la presencia de flavonoides en el extracto de GP, la mejora del cierre de la herida se observó solo después de ocho y 10 horas. Sin embargo, los resultados del ensayo de raspado no fueron estadísticamente significativos.Ir:

4.2. Material vegetal

GP se recogió (junio de 2016) del jardín del Departamento de Productos Naturales Medicinales y Cosméticos de la Universidad de Ciencias Médicas de Poznan y se secó a temperatura ambiente. La muestra del comprobante (No Gp-2016) se depositó en el Departamento de Farmacognosia de la Universidad de Ciencias Médicas de Poznan.

4.3. Preparación de extractos

La hierba de GP (5,0 g) se extrajo con metanol al 50% (dos veces a 250 ml) durante 20 min a 95 ° C en un baño de agua. El extracto se concentró al vacío a 40 ° C hasta que se secó. El residuo obtenido se diluyó con 50 ml de agua para producir una solución madre (0,1 g de hierba seca / ml) que se utilizó en experimentos adicionales. Las concentraciones finales del extracto de GP utilizado se expresan como mg de hierba seca por ml.

De la misma forma se preparó un extracto para el aislamiento de flavonoides (a partir de 1000 g).

4.5.7. Cicatrización de la herida

El ensayo se realizó como se describió anteriormente [ 42 , 43 ]. Las células se cultivaron hasta la confluencia y luego se rasparon con un raspador de células (Nunc). Los residuos resultantes se eliminaron mediante un lavado suave con medio. Después de eso, las células se mantuvieron durante hasta 12 h en medio de cultivo estándar con GP (0,5 a 1,0 mg / ml) o control de vehículo en una incubadora acoplada a un microscopio invertido Axio Observer D1 (Zeiss). Las imágenes de la herida que se cerró se adquirieron mediante microscopía de lapso de tiempo a intervalos de 30 minutos y se analizaron con AxioVision Rel. 4.6.3 software de análisis de imágenes (Zeiss). Los datos se expresaron como porcentaje de regeneración en cada intervalo de tiempo.

El ensayo de raspado de heridas es un método bien establecido para estudiar la cicatrización de heridas in vitro y se cree que es especialmente adecuado para medir la migración celular [ 44 ].

5. Conclusiones

La actividad antiinflamatoria del rico extracto de polifenoles de la hierba GP está relacionada, al menos en parte, con la actividad de eliminación de radicales libres, la inhibición de la liberación de IL-6 y un efecto inhibidor sobre la actividad de la hialuronidasa. Los resultados de este estudio demuestran que dicho extracto vegetal podría tener potencial como fármaco en el tratamiento de trastornos cutáneos.Ir:

Materiales complementarios

Los materiales complementarios están disponibles en línea.Haga clic aquí para obtener un archivo de datos adicional. (3,5 M, pdf)Ir:

Determinación de la actividad antioxidante y protectora de los rayos UV in vitro de extractos acuosos y etanólicos de la hierba Galinsoga parviflora y Galinsoga quadriradiata

Antecedentes: Entre las radiaciones solares, la luz ultravioleta es la más dañina para la piel, debido a la formación de especies reactivas de oxígeno intracelular, que provocan estrés oxidativo, daño celular y apoptosis. El papel fundamental en la protección de la piel contra el estrés oxidativo juegan las enzimas antioxidantes reguladas por el factor de transcripción Nrf2. Se sabe que algunos polifenoles de origen vegetal protegen los fibroblastos de la piel contra los rayos UV mediante la inducción de la expresión de genes antioxidantes dependientes de Nrf2.

Objetivo: averiguamos anteriormente que los extractos de agua de Galinsoga sp. La hierba protegía los fibroblastos dérmicos humanos contra el estrés oxidativo y la apoptosis inducidos por los rayos UVA. Sin embargo, no estaban claros qué compuestos eran responsables de dicha acción protectora. Aquí, investigamos el potencial fotoprotector y el mecanismo de acción de dos compuestos aislados principales, ácido 2,3,5 (2,4,5) -tricafeoilaltrarico y ácido 2,4 (3,5) -dicafeoilglucárico, en fibroblastos dérmicos humanos (NHDF). ).

Diseño / métodos del estudio: las células NHDF se pretrataron con compuestos ensayados (6,25-50 µM) y se irradiaron con UVA (25 J / cm 2 ). Se midieron el nivel intracelular de ROS y GSH, la viabilidad celular, la integridad de la membrana celular y la apoptosis. También se evaluaron la expresión de la proteína HO-1 y la activación del factor de transcripción Nrf2.

Resultados: Las células pretratadas con compuestos probados antes de los rayos UVA mostraron inhibición de la formación de ROS intracelulares y aumento del nivel de GSH. También se observó un aumento significativo de la viabilidad celular, así como una disminución de la liberación de LDH y una tasa de células apoptóticas en comparación con las células no tratadas. Además, los compuestos probados aumentaron la expresión de HO-1 y activaron el factor de transcripción Nrf2 en las células NHDF.

Conclusión: El presente estudio demostró que los derivados del ácido cafeico presentes en la hierba Galinsoga parviflora, en particular el ácido tricafeoilaltrarico, pueden proteger los fibroblastos dérmicos contra el estrés oxidativo inducido por los rayos UVA mediante la activación del sistema antioxidante intracelular. Dichos derivados del ácido cafeico son compuestos bioactivos que podrían prevenir el fotoenvejecimiento y la fotocarcinogénesis inducidos por los rayos UV.

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